当益生菌被摄入时，它们首先接触到的是口腔中的唾液。唾液是一种透明的微酸性黏液，具有润滑口腔黏膜、溶解食物和辅助吞咽的作用。唾液中的免疫成分包括分泌性免疫球蛋白A (IgA)、免疫球蛋白G (IgG)和免疫球蛋白M (IgM)。非免疫成分包括蛋白质、黏蛋白、多肽和酶等。因此，唾液也具有一定的抗菌作用，可选择性支持非致龋菌群的生长。体外研究表明，唾液对乳杆菌、片球菌和双歧杆菌菌株的生长没有显著抑制作用。此外由于接触时间较短，唾液对益生菌的影响可以说微乎其微。

吞咽后益生菌经食道到达胃，在那里它们将面临此次旅途的第一个大的挑战——胃酸。胃酸的pH约为1-3，属于极酸性条件，可导致细菌细胞质pH值降低，对大多数细菌是极其致命的。益生菌在胃部停留的时间大约为5分钟-2小时，如果长时间处于胃酸环境中，对益生菌活性将产生较大影响。此外，胃中的高离子强度、胃蛋白酶、以及机械搅动等都会对益生菌产生不利影响。

通过幽门后，益生菌将到达含有大量胰液和胆汁的小肠。在小肠液的中和下，小肠中的pH上升到6-7，较为适宜益生菌的生长，但小肠液中的胆汁酸以及消化酶（如脂肪酶，蛋白酶和淀粉酶等）依然会在一定程度上破坏益生菌的细胞结构，或者对胞内DNA造成损伤。

结肠中含有人体内数量最大、密度最高的菌群（10^11-10^12CFU/ml），因此益生菌在结肠内通常需要面对来自结肠共生菌的定殖抵抗。益生菌必须与宿主菌群争夺养分和黏附位点，才能在结肠粘膜上定殖。未成功定殖的益生菌会在不久后随粪便排出体外。